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上海生科院在植物中实现A·T- G·C的单碱基替换

上海生科院在植物中实现A·T- G·C的单碱基替换

  2月22日,中国科学院上海植物逆境生物学研究中心朱健康研究组的研究论文,以Precise A·T to G·C base editing in the rice 腾讯分分彩genome为题,在线发表在Molecular Plant上。该研究报道了一种新型腺嘌呤碱基编辑器ABE7-10在水稻中的应用。它可以将水稻基因组特定位点的上A·T碱基对高效的转化为G·C碱基对。此研究扩展了植物中可用的单碱基编辑工具,并将进一步推动水稻等其他作物的分子精准育种。

  碱基置换突变指一个碱基被另一个碱基取代,是最常见的突变形式。越来越多的研究表明,大部分生物性状的改变都存在着相关基因的突变,其中以碱基置换突变即点突变最为常见。寻求高效的单碱基编辑技术一直以来是植物研究的热点和难点。2017年10月,哈佛大学David Liu实验室在Nature上发表了题为Programmable base editing of A?T to G?C in genomic DNA without DNA cleavage的研究论文,报道了一种新型的腺嘌呤碱基编辑器ABE,可以将基因组中特定位点的A·T碱基对高效的转化为G·C碱基对。该研究进一步扩展了目前基于CRISPR/Cas9的单碱基编辑工具。但ABE是以大肠杆菌tRNA腺嘌呤脱氨酶为基础,经过7轮的突变进化改造而得到的,虽然它能对哺乳动物细胞中的多个位点能够进行高效碱基编辑,但在植物中是否也可以高效利用尚不清楚。

  基于哺乳动物细胞中已发表的结果,朱健康研究组在水稻中开发了一种新的腺嘌呤碱基编辑系统。研究人员合成了野生型TadA和其突变形式TadA7-10,并将其用特定的街头连接到Cas9(D10A)的N端,同时将VirD2的核定位信号肽(NLS)添加到Cas9(D10A)的C末端,形成ABEP1腺嘌呤碱基编辑器。ABEP1在水稻中由玉米泛素启动子驱动表达。研究人员首先选择对水稻基因组中的OsSPL14SLR1位点进行单碱基编辑,A·T到G·C的替换的效率分别为26%和12.5%。为了证实该碱基编辑器能够同时对基因组多个靶位点同时进行编辑,研究设计了单个sgRNA同时靶向基因组中的多个位点。结果表明水稻基因组多个位点可以被ABEP1同时编辑。ABEP1依赖于SpCas9识别靶位点,而腾讯分分彩 SpCas9识别靶位点依赖于NGG PAM序列,这限制了水稻基因组中可被编辑的位点。为了进一步扩展水稻基因组中可被编辑的位点,研究设计ABEP2腺嘌呤碱基编辑器,其识别靶位点依赖于SaCas9。而SaCas9识别靶位点依赖于NNGRRT PAM序列。对水稻基因组的多个基因进行定点编辑表明ABEP2同样能够对目标位点进行高效的碱基替换,有些位点的效率高达61.3%。同时,ABEP2可以对多个位点进行同时编辑。对所有的编辑位点测序后研究人员发现没有任何位点产生碱基插入、缺失或者其他形式的碱基替换,说明腺嘌呤碱基编辑器精确性很高。

  结合研究组此前开发的基于APOBEC1酶的碱基编辑器,可以在水稻基因组中实现对DNA四种不同碱基的高效替换(A-G, T-C, C-T, G-A)。这将进一步推动水稻功能基因组研究,并对作物分子精准育种产生重大影响。

  抗逆中心博士研究生华凯为论文第一作者,研究员朱健康为通讯作者。生物技术平台为该研究提供了技术支持,研究工作得到中科院的资助。

  A.水稻中两种腺嘌呤碱基编辑器的载体示意图 B.OsSPL14中的靶位点示意图,miR156结合位点由红色字体标出 C.两株代表性的转基因植株的测序峰图,黑色箭头指示出编辑位点 D.不同sgRNA编辑效率的统计信息